Лабораторный практикум по общей микробиологии

Loading...


бет6/20
Дата13.04.2020
өлшемі253.08 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   20

Морфология спирохет



Цель работы. Изучить морфологию спирохет, выявляемых в препа- рате из зубного налѐта, окрашенном негативным методом по Бурри.

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, по- кровные стекла, пинцет, стерильные палочки, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипет- ки объемом 1 и 2 см3, дистиллированная вода, черная тушь, этиловый спирт, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы


  1. Приготовьте мазок из зубного налета, взятого стерильной палоч кой. Нанесите на сухой мазок раствор негативного красителя (жидкая тушь, конго красный), высушите.

  2. Можно приготовить препарат вторым способом: каплю исследуе мой суспензии бактерий смешать с красителем непосредственно на пред метном стекле, накрыть еѐ покровным стеклом.

  3. Сухой препарат (или приготовленный вторым способом) рас смотрите под иммерсией.

  4. Зарисуйте: на темном фоне туши видны неокрашенные большая и малая зубные спирохеты - Spirochaeta macrodenta и Spirochaeta microdenta.

Лабораторная работа № 7

Морфология споровых микроорганизмов, микобактерий и актиномицетов



Цель работы. Ознакомиться с морфологией споровых микроорга- низмов, микобактерий и актиномицетов.

Материалы и оборудование. Микроскоп, готовые препараты спо- ровых микроорганизмов, микобактерий и актиномицетов, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы


  1. Просмотрите готовые препараты микроорганизмов с иммерсион ной системой.

  2. Зарисуйте каждый препарат в альбом.

Лабораторная работа № 8



Морфология дрожжевых грибов



Цель работы. Изучить морфологию клеток дрожжевых грибов.

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, по- кровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, ка- рандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, чистые культуры дрожжей, красители (кристал- лвиолет, фуксин Циля, метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), раствор Люголя, этиловый спирт, иммер- сионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы


  1. Приготовьте мазок из чистой культуры дрожжей.

  2. Окрасьте фиксированный мазок по Грамму.

  3. Полученный препарат рассмотрите под иммерсией.

  4. Зарисуйте в альбом.

4. Морфология клеточных структур



Клеточная стенка. Тонкую структуру клеточной стенки хорошо видно лишь в электронном микроскопе. Для наблюдения клеточной стенки в световом микроскопе применяют метод темного поля либо специальную окраску, с помощью которой удается легко выявить границы между от- дельными клетками, расположенными в виде длинных нитей или плотных агрегатов. На обезжиренном стекле делают мазок клеток исследуемых бак- терий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 5 мин 5%-ным раствором фосфоромолибденовой кислоты. Затем препарат промывают во- дой и окрашивают не более 15 мин 0,02%-ным раствором кристаллвиолета. Снова промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клеточная стенка окрашивается в черный цвет, а цитоплазма - в бледно-сиреневый.

Выявление кислотоустойчивости. Кислотоустойчивость - свойст- во, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключает- ся в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кисло- той. Наибольшее распространение получил способ выявления кислото- устойчивости по Циль-Нильсену. На обезжиренном предметном стекле го- товят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых мико- бактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и затем 2 - 3 раза подогревают его до появле- ния паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением па- ров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тотчас отстав- ляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. За- тем препарат обесцвечивают 5%-ным раствором Н2SO4. Для этого пред- метное стекло погружают 2 - 3 раза в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3 - 5 мин метиловым синим по Леффлеру. Краску сливают, препарат промывают во- дой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. При строгом со- блюдении режима окраски кислотоустойчивые клетки приобретают крас- ный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий.

Нуклеоид. Довольно четко нуклеоид обнаруживается у следующих бактерий: Proteus vulgaris, Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium,

Bacillus mycoides, Bacillus subtilis. На предметном стекле делают мазок су- точной культуры бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в те- чение 2 - 3 мин в парах осмиевой кислоты. С этой целью на дно чашки Петри наносят 2 - 3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают маз- ком вниз на обрезки стекла. По окончании фиксации препарат опускают на 2 - 3 мин в стаканчик с раствором 1 н. HCl для гидролиза рибосомальной РНК. Стакан держат на водяной бане при 60 °С. После гидролиза препа- рат немедленно промывают водой. Затем мазок помещают на 15 мин в 1%-ный раствор формалина, вновь промывают водой и окрашивают в тече- ние 1 - 2 мин 0,1 - 1,0%-ным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый.

Эндоспоры. Эндоспоры образуют бактерии родов Bacillus, Clostridium и некоторых других. Для обнаружения способности клеток к спорообразованию лучше использовать старые культуры. Споры можно обнаружить при наблюдении живых клеток, а также путем дифференци- ального окрашивания цитоплазмы и споры. В случае выявления у микро- организма способности к образованию спор необходимо обратить внима- ние на тип спорообразования (бациллярный, клостридиальный, плектриди- альный), расположение споры в клетке (центральное, эксцентральное или полярное), форму свободных спор (круглая, овальная или продолговатая) и определить их размеры. С этой целью просматривают клетки 2 - 3 - суточной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий про- ходят за этот период времени все стадии развития - от вегетативной клет- ки до свободной споры.

Наблюдение спор в живых клетках. Споры по сравнению с цито- плазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более тем- ные включения округлой или овальной формы. При использовании фазо- во-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток.

Метод выявления спор негативным окрашиванием. На предметном стекле готовят тонкий мазок клеток спорулирующих бактерий, подсуши- вают на воздухе и фиксируют в пламени. Затем на 3 - 5 мин наносят мети- леновый синий или на 1 - 3 мин фуксин, после чего препарат осторожно просушивают на воздухе. Просматривают с иммерсией.

Вегетативные клетки бактерий прокрашиваются, а споры, имеющие многослойную, труднопроницаемую оболочку - нет. Они видны как силь- но преломляющие свет сферические или овальные образования, находящиеся в зависимости от стадии спорообразования внутри или вне клеток бактерий.

Метод удобен при количественной оценке процесса спорообразова- ния путем подсчета количества спор и вегетативных клеток в разных усло- виях роста бактерий.

Дифференциальная окраска споры по методу Пешкова. Споры и ци- топлазму окрашивают при нагревании. Промывание препарата водой ведет к обесцвечиванию цитоплазмы, тогда как спора прочно удерживает краситель.

На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высушивают его на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиле- нового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения, держа пред- метное стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добав- ляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента за- кипания красителя, - 10 - 20 с. Затем предметное стекло охлаждают, пре- парат тщательно промывают водой, после чего клетки в течение 30 с до- крашивают 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного или саф- ранина. Краситель сливают, препарат промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный цвет, а споры - синий. Вместо метиленового синего можно ис- пользовать малахитовый зеленый. В этом случае препарат, фиксированный в пламени горелки, заливают на 7 - 10 мин 7,5%-ным раствором малахито- вого зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают, промывают препарат водой и до- крашивают клетки 0,25%-ным водным раствором сафранина в течение 1 - 2 мин. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки - в розовый.



Окраска капсулы. Эти структуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании живых клеток. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить каким- либо одним методом окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко де- формируются, а вещество капсулы слабо связывает краситель, который легко отмывается в процессе обработки препарата. Чаще всего для выяв- ления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного кон- трастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество

клеток с плотной среды помещают в каплю разбавленного фуксина, сме- шивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40 х. На общем темном фоне препарата хорошо видны бес- цветные капсулы, окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет.



Окраска капсул по методу Гинса. На конец предметного стекла микро- биологической петлей наносят каплю черной туши, вносят в нее клетки, хо- рошо перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок по всей по- верхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5 - 10 мин смесью Никифорова или 3 мин абсолютным метанолом. Далее мазок ок- рашивают карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в соотноше- нии 1:3. Время окрашивания - 2 - 3 мин. Препарат промывают водой, вы- сушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. На темно-сером фоне препарата контрастно выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными капсулами.

Окраска по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицатель- ные. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом при обработке препарата спиртом и поэтому окраши- ваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают та- кой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обра- ботке фуксином или сафранином они приобретают розовую окраску.

Окраска по Граму заключается в следующем. На одном обезжирен- ном стекле делают мазки разных микроорганизмов: в центре - мазок кле- ток исследуемой культуры, слева и справа - контрольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть грамположительными (напри- мер Micrococcus luteus или Bacillus cereus), другой - грамотрицательными (например Escherichia coli). Мазки следует готовить тонкими, чтобы клет- ки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 - 2 мин карболовым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Затем краситель сливают и, не промывая мазок водой, обрабатывают его 1 - 2 мин раствором Люголя до почерне- ния. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 0,1 - 1,0 мин 96%- ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окра- шивают 1 - 2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промы-

вают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине- фиолетовый цвет, грамотрицательные - розово-красный.

Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов. Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК. Для этого на предметное стекло на- носят каплю 3%-ного раствора КОН и 1 петлю 24-часовой исследуемой агаровой культуры, тщательно перемешивают. При тестировании грамот- рицательных культур через 5 - 7 с при движении петли вверх образуется слизистый след длиной 1 - 2 см; если слизь не образуется, то тестируемая культура грамположительная.

Лабораторная работа № 9





Достарыңызбен бөлісу:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   20
Loading...


©melimde.com 2020
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет
рсетілетін ызмет
Жалпы ережелер
ызмет стандарты
дістемелік кешені
бекіту туралы
туралы хабарландыру
біліктілік талаптары
кіміні аппараты
Конкурс туралы
жалпы біліктілік
ойылатын жалпы
мемлекеттік кімшілік
жалпы конкурс
білім беретін
Барлы конкурс
республикасы білім
бойынша жиынты
ызмет регламенті
ткізу туралы
конкурс атысушыларына
біліктілік талаптар
атысушыларына арнал
идаларын бекіту
Республикасы кіметіні
облысы кімдігіні
рсетілетін ызметтер
мемлекеттік ызмет
стандарттарын бекіту
Конкурс ткізу
мемлекеттік мекемесі
дістемелік сыныстар
Мектепке дейінгі
дебиеті маманды
дістемелік материалдар
білім беруді
ауданы кіміні
жалпы білім
конкурс туралы
мектепке дейінгі
рметті студент
облысы бойынша
мыссыз азаматтар
Мемлекеттік кірістер
дарламасыны титулды
Конкурс жариялайды
дістемелік кешен
мерзімді жоспар
разрядты спортшы
мелетке толма
ызметтер стандарттарын
директоры бдиев

Loading...