Лабораторный практикум по общей микробиологии


Методы приготовления препаратов для микроскопии

Loading...


бет3/20
Дата13.04.2020
өлшемі253.08 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   20

Методы приготовления препаратов для микроскопии



Микроскопия

Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величи- на которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм =



= 10 мм = 10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечи- вающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроско- пия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в све- товом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает в себя обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную.

Светлопольная микроскопия. Существуют различные модели учеб- ных и исследовательских световых микроскопов, которые позволяют оп- ределить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, сте- пень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроор- ганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию.

Правила пользования микроскопом. Строгое соблюдение правил пользования микроскопом является непременным условием для каждого работающего с ним. При работе необходимо соблюдать следующую по- следовательность :

  1. Устанавливают микроскоп в рабочее положение, т.е. так, чтобы колонка была обращена в сторону исследователя, а зеркало - в направле нии источника света.

  2. Ставят под тубус, пользуясь револьвером, объектив малого увеличе ния. Как правило, предмет рассматривают вначале при малом увеличении.

  3. Проверив, открыта ли диафрагма и поднят ли конденсор, вращают, глядя в окуляр, зеркало и устанавливают его так, чтобы поле зрения оказа лось хорошо освещенным.

  4. Помещают препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы рассматриваемый объект оказался над отверстием столика. Препарат за крепляют с помощью клемм.

  5. Находят фокусное расстояние, для чего опускают или поднимают тубус с помощью макрометрического винта. Для окончательной фокуси ровки пользуются микрометрическим винтом.

При смене объектива, дающего малое увеличение, на объектив большего увеличения требуется соблюдение следующих правил:

  1. Прежде чем сменить объектив, рассматриваемый объект (или его участок) ставят в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении. Диаметр линзы уменьшается по мере возрастания степени увеличения, вследствие чего объект, если он лежит не в центре, при смене объектива может оказаться за пределами поля зрения.

  2. Слегка приподнимают тубус и затем переводят объектив с помо щью револьвера. Это необходимо потому, что объектив большего увели чения всегда бывает длиннее.

  3. Для того чтобы в поисках фокусного расстояния не раздавить пре парат или, что еще хуже, не повредить линзу объектива, тубус с подведен ным под него объективом, глядя для контроля сбоку микроскопа, опускают

до самой поверхности препарата и затем, смотря в окуляр, очень медленно (чтобы не пропустить появления очертаний предмета) поднимают.

Рассматривают препарат в микроскоп левым глазом. Правый глаз при этом должен оставаться открытым. Левую руку держат на микромет- рическом винте и слегка вращают его (влево и вправо). Этим достигается возможность рассмотрения поверхностных и более глубоких участков объ- екта. Правой (свободной) рукой делают зарисовку того, что видно в поле зрения.



Правила работы с иммерсионным объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет. Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно про- водить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения. После погру- жения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, под- нимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта.

По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают пре- парат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала су- хой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной ксилолом. Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа.



Изучение микроорганизмов в световом микроскопе. Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования.

Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2 - 1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осве- тителя в плоскости препарата. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу. Это достигается протиранием стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхно- сти стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает).



Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов мик- роорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщи- на покровных стекол не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые по- кровные стекла резко ухудшают качество получаемого изображения.

Препараты живых клеток микроорганизмов

  1. «Раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю водо проводной воды и помещают в нее небольшое количество клеток изучае мых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей, выращенные в жидкой среде - стерильной пипеткой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жид кости необходимо удалить фильтровальной бумагой.

  2. «Висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей нано сят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна висеть свободно, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предва рительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объ ектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а сус пензию микроорганизмов готовят на жидкой питательной среде.

Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает сле- дующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

  1. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала как для препа рата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазы вают петлей на площади 1 - 2 см2 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал после приготовления.

  2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно

слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, дер- жа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

  1. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроор ганизмы, то есть сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обес печить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более воспри имчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем жи вые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточ ных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщива ние. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фик сатором.

  2. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивает ся вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Диф ференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, по- крытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтро- вальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашен- ном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окраше- ны только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препа- раты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Лабораторная работа № 2





Достарыңызбен бөлісу:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   20
Loading...


©melimde.com 2020
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет
рсетілетін ызмет
Жалпы ережелер
ызмет стандарты
дістемелік кешені
бекіту туралы
туралы хабарландыру
бойынша жиынты
біліктілік талаптары
кіміні аппараты
Конкурс туралы
жалпы біліктілік
ойылатын жалпы
мемлекеттік кімшілік
білім беретін
жалпы конкурс
Барлы конкурс
республикасы білім
ызмет регламенті
ткізу туралы
конкурс атысушыларына
біліктілік талаптар
атысушыларына арнал
дістемелік сыныстар
Республикасы кіметіні
идаларын бекіту
облысы кімдігіні
мемлекеттік ызмет
рсетілетін ызметтер
мемлекеттік мекемесі
стандарттарын бекіту
Конкурс ткізу
Мектепке дейінгі
дебиеті маманды
білім беруді
жалпы білім
дістемелік материалдар
мектепке дейінгі
ауданы кіміні
мерзімді жоспар
конкурс туралы
облысы бойынша
рметті студент
мыссыз азаматтар
Мемлекеттік кірістер
дарламасыны титулды
Конкурс жариялайды
дістемелік кешен
разрядты спортшы
мелетке толма
ызметтер стандарттарын
аласы кіміні

Loading...