Лабораторный практикум по общей микробиологии


Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)

Loading...


бет13/20
Дата13.04.2020
өлшемі253.08 Kb.
1   ...   9   10   11   12   13   14   15   16   ...   20

Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)

В основе метода лежит принцип Коха, согласно которому каждая ко- лония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содер- жании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного учета микроорганизмов, проведенного методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных единицах - так называемых колониеобразующих еди- ницах (КОЕ).



45

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.



Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавлен- ную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 - 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверх- ности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посе- вом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационной воды.

После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего раз- ведения и равномерно распределяют по поверхности среды.



При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1; 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48 - 50 °С агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть.

Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависи- мости от скорости роста подсчитывают через 2 - 15 сут инкубации. Под- счет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каж- дую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на сек- торы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Результаты учитывают на тех чашках Петри, на которых вырастает от 30 - 50 до 100 - 150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле





V


где М - количество клеток в 1 мл;

а - среднее число колоний на чашке Петри; V —

объем суспензии, взятый для посева, мл; 10n - коэффициент разведения.

Необходимо помнить, что статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке.



    1. Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом

В основе метода лежит измерение уменьшения количества света при его прохождении через суспензию клеток. В определенных пределах оно и пропорционально концентрации клеток и обусловлено преимущественно рассеянием света клетками. Величина этого показателя зависит от многих факторов (формы и размеров клеток, оптических свойств культуральной среды, длины волны падающего света и т.д.). Поэтому нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений. Питательная среда, в которой предполагается определять число клеток, должна быть оптически прозрачной. Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют с помощью фотоэлектро- колориметра (ФЭК) или спектрофотометра, выбирая длину волны (обычно в интервале 540 - 650 нм), при которой поглощение света данной суспен- зией клеток является минимальным.



    1. Стандарты мутности и их применение

В ряде случаев количество клеток в суспензии бывает достаточно определить визуально путем сравнения со стандартом мутности. Стандар- ты мутности, выпускаемые государственным НИИ стандартизации и кон- троля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича, представляют собой взвесь частиц стекла пирекс в дистиллированной воде. За единицу стандарта мутности общего назначения условно принята мут- ность суспензии в физиологическом растворе бактерий - возбудителей ти- фа с концентрацией клеток 100 млн/мл. Стандарт мутности включает 4 эталона на 10, 11, 9 и 5 единиц, что соответствует содержанию 1-10 ; 1,1-Ю9; 0,9-109 и 0,5-Ю9 клеток в 1 мл взвеси. Для определения количества клеток пробирку с исследуемой суспензией ставят рядом с эталоном 10 и рассматривают их в отраженном и проходящем свете на фоне белого листа бумаги, в центре которого нанесено несколько черных линий.



Лабораторная работа № 17

Подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева



Цель работы. Освоить метод подсчета микробных клеток в камере Горяева.

Материалы и оборудование. Микроскоп, счетные камеры Горяева, бактериологические петли, спиртовка, стерильная дистиллированная вода, чистые культуры дрожжей, стерильные пипетки вместимостью 1-2 мл.

Ход выполнения работы


  1. Приготовьте последовательные 10-кратные разведения исходной

1 9 "3

суспензии дрожжей: 10-1 , 10-2 , 10-3 4,5 мл дистиллированной воды до- бавьте 0,5 мл суспензии дрожжей).

  1. При увеличении 20 х или 40 х проведите подсчет клеток дрожжей в камере Горяева под микроскопом.

  2. Результаты работы оформите в виде табл. 3.

Таблица 3

Учет количества клеток дрожжей в камере Горяева


Разве- дение

Повтор- ность

Количество клеток дрожжей в большом квадрате камеры Горяева

Общее число клеток в малых квадратах

Среднее число клеток

Количе- ство клеток в исход- ном образце

1

2

3

4

5










10-1




























10-2




























10-3




























Лабораторная работа № 18





Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   9   10   11   12   13   14   15   16   ...   20
Loading...


©melimde.com 2020
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет
рсетілетін ызмет
Жалпы ережелер
ызмет стандарты
дістемелік кешені
бекіту туралы
туралы хабарландыру
бойынша жиынты
біліктілік талаптары
кіміні аппараты
Конкурс туралы
жалпы біліктілік
ойылатын жалпы
мемлекеттік кімшілік
білім беретін
жалпы конкурс
Барлы конкурс
республикасы білім
ызмет регламенті
ткізу туралы
конкурс атысушыларына
біліктілік талаптар
атысушыларына арнал
дістемелік сыныстар
Республикасы кіметіні
идаларын бекіту
облысы кімдігіні
мемлекеттік ызмет
рсетілетін ызметтер
мемлекеттік мекемесі
стандарттарын бекіту
Конкурс ткізу
Мектепке дейінгі
дебиеті маманды
білім беруді
жалпы білім
дістемелік материалдар
мектепке дейінгі
ауданы кіміні
мерзімді жоспар
конкурс туралы
облысы бойынша
рметті студент
мыссыз азаматтар
Мемлекеттік кірістер
дарламасыны титулды
Конкурс жариялайды
дістемелік кешен
разрядты спортшы
мелетке толма
ызметтер стандарттарын
аласы кіміні

Loading...